Strandverschiebung während der Synthese von Desoxyribonukleinsäure an Einzelstrangbrüchen

Zusammenfassung Die Synthese von DNA durch DNA-Polymerasen wurde unter Verwendung von zirkulären Duplex-DNA-Vorlagen untersucht, die einzelne Phosphodiesterbindung Unterbrechungen (nicks) enthalten. Escherichia coli DNA-Polymerase kann die Synthese an nicks durch die kovalente Bindung von Nukleotiden an das 3'-Ende des Primerstrangs initiieren. Eine anfängliche Phase der Synthese wird von der Entfernung von Nukleotiden vom 5'-Ende des nicks durch die 5'-hydrolytische Aktivität der E. coli-Polymerase begleitet (nick-Translation). Nach der Einfügung von 10 bis 50 Nukleotiden wird das 5'-Ende des Primerstrangs durch das wachsende 3'-Ende des Primerstrangs verdrängt. Die Eliminierung der 5'-hydrolytischen Aktivität der E. coli-Polymerase verhindert diese Strandverschiebung nicht. Im Gegensatz dazu kann die Phage T4-Polymerase die Synthese an nicks nicht initiieren. In diesen Studien wurde Polynukleotid-Ligase verwendet, um nicks zu identifizieren und ihr Verschwinden während der Strandverschiebung zu messen. Die während der Phase der Strandverschiebung synthetisierte DNA ist empfindlich gegenüber sowohl Exonukleasen I als auch III von E. coli. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass ein Gleichgewicht zwischen einsträngigen und doppelsträngigen Formen der neu synthetisierten DNA besteht. Eine dritte Phase einer umfangreicheren Synthese ergibt ein DNA-Produkt, das selbst nach Denaturierung resistent gegenüber Exonuklease I ist, was auf eine selbstkomplementäre Struktur hinweist. Elektronenmikroskopische Aufnahmen eines solchen Produkts, das auf zirkulärer PM2-DNA mit einem nick pro Molekül synthetisiert wurde, zeigen einen einzelnen Ast, der vom intakten Kreis ausgeht. Die anschließende Synthese erzeugt zahlreiche Äste.