Analyse der Rezeptorsignalisierungswege mittels Massenspektrometrie: Identifizierung von Vav-2 als Substrat der epidermalen und plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptoren

Die Oligomerisierung von Rezeptor-Protein-Tyrosin-Kinasen wie dem epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) durch ihre korrespondierenden Liganden führt zur Aktivierung des Rezeptors. Auf die Transphosphorylierung der Rezeptor-Untereinheiten folgt die Rekrutierung von Signalmolekülen, die SH2-Domänen (src Homologie 2) oder Phosphotyrosin-Interaktionsdomänen (PID) enthalten. Darüber hinaus erfahren mehrere zytoplasmatische Proteine, die mit dem Rezeptor assoziieren können oder nicht, eine Tyrosinphosphorylierung. Um mehrere Komponenten des EGFR-Signalisierungswegs in einem einzigen Schritt zu identifizieren, haben wir Moleküle, die in Reaktion auf EGF tyrosinphosphoryliert sind, immunopräzipitiert und sie anschließend durch eindimensionale Gel-Elektrophorese gefolgt von Massenspektrometrie analysiert. Die Kombination von Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisierung (MALDI) und Nanoelektrospray-Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) führte zur Identifizierung von neun Signalmolekülen, von denen sieben zuvor mit der EGFR-Signalisierung in Verbindung gebracht worden waren. Mehrere dieser Moleküle konnten aus niedrigen Femtomol-Proteinmengen identifiziert werden, die auf das Gel geladen wurden. Wir identifizierten Vav-2, einen kürzlich entdeckten Guanosin-Nukleotid-Austauschfaktor, der ubiquitär exprimiert wird, als Substrat des EGFR. Wir zeigen, dass Vav-2 an Tyrosin-Resten in Reaktion auf EGF phosphoryliert wird und in vivo mit dem EGFR assoziiert. Die Bindung von Vav-2 an den EGFR erfolgt über die SH2-Domäne von Vav-2. Entsprechend seiner ubiquitären Expression scheint Vav-2 ein allgemeines Signalmolekül zu sein, da es auch mit dem plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF)-Rezeptor assoziiert und in Fibroblasten nach PDGF-Stimulation einer Tyrosinphosphorylierung unterzogen wird. Die hier vorgeschlagene Strategie kann zur routinemäßigen Identifizierung von downstream-Komponenten von Zelloberflächenrezeptoren in Säugetierzellen verwendet werden.