Studie der Interaktionen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien durch In Situ Nähe-Ligationstest in fixierten Zellen

Strukturelle Interaktionen zwischen den Membranen des endoplasmatischen Retikulum (ER) und der Mitochondrien, in Bereichen, die als mitochondrien-assozierte Membranen (MAM) bekannt sind, sind entscheidende Knotenpunkte für zelluläre Signalübertragung und Zellschicksal. Insbesondere ermöglichen diese Interorganellen-Kontaktstellen den Transfer von Calcium vom ER zu den Mitochondrien durch den spannungsabhängigen Anionenkanal (VDAC)/glucose-reguliertes Protein 75 (GRP75)/Inositol 1,4,5-Triphosphat-Rezeptor (IP3R) Calcium-Kanal-Complex. Während dieser subzelluläre Kompartiment intensiv sowohl unter physiologischen als auch pathologischen Bedingungen untersucht wird, existiert kein einfaches und sensibles Verfahren, um die endogene Menge an ER-Mitochondrien-Kontakt in Zellen zu quantifizieren. Ähnlich sind MAMs hochdynamische Strukturen, und es gibt keinen geeigneten Ansatz, um Veränderungen in den ER-Mitochondrien-Interaktionen ohne Proteinüberexpression zu verfolgen. Hier berichten wir über ein optimiertes Protokoll, das auf der Verwendung eines In Situ Nähe-Ligationstests basiert, um endogene ER-Mitochondrien-Interaktionen in fixierten Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren, indem die enge Nähe zwischen den Proteinen der äußeren Mitochondrienmembran (VDAC1) und der ER-Membran (IP3R1) an der MAM-Schnittstelle genutzt wird. Ähnliche In Situ Nähe-Ligationsexperimente können auch mit den Antikörperpaaren GRP75/IP3R1 und Cyclophilin D/IP3R1 durchgeführt werden. Dieser Test bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Bildgebungsverfahren, da er hochspezifisch, sensitiv und für Tests unter mehreren Bedingungen geeignet ist. Daher sollte die Anwendung dieses In Situ Nähe-Ligationstests hilfreich sein, um die physiologischen Regulationsmechanismen der ER-Mitochondrien-Interaktionen sowie deren Rolle in pathologischen Kontexten besser zu verstehen.