Charakterisierung der Helicase- und Primaseaktivitäten der 63-kDa-Komponente des Bakteriophagen T7 Gen 4 Proteins

Die Synthese von DNA an der Replikationsgabel des Bakteriophagen T7 DNA für führende und nachfolgende Stränge erfordert die Helicase- und Primaseaktivitäten des Gen 4 Proteins. Das Gen 4 Protein besteht aus zwei kolinearen Polypeptiden mit molekularen Massen von 56 kDa und 63 kDa. Wir haben zuvor gezeigt, dass das 56-kDa Protein Helicaseaktivität besitzt, aber keine Primaseaktivität aufweist (Bernstein, J. A., und Richardson, C. C. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 396-400). Das 63-kDa Gen 4 Protein wurde jetzt aus Extrakten von T7-infizierten Zellen isoliert. Die Zubereitung enthält 5-10% kontaminiertes 56-kDa Protein, wie durch Western-Analyse mit polyklonalen Antikörpern gegen das gereinigte 56-kDa Protein gezeigt wurde. Das 63-kDa Protein katalysiert die DNA-abhängige dTTP-Hydrolyse und weist Helicaseaktivität auf; beide spezifischen Aktivitäten sind ähnlich denen, die für das 56-kDa Protein bestimmt wurden. Das 63-kDa Protein synthetisiert effizient sequenzspezifische Di-, Tri- und Tetraribonukleotide und stimuliert die Verlängerung von Tetraribonukleotiden durch die T7 DNA-Polymerase. Obwohl das 56-kDa Protein allein keine Primaseaktivität aufweist, verstärkt es die Primaseaktivität des 63-kDa Proteins um das Vierfache. Diese Stimulation kann durch einen ähnlichen Anstieg der Menge an Primern, die im Beisein des 56-kDa Proteins vom 63-kDa Protein synthetisiert werden, erklärt werden.