Transfer des C.alpha.-Wassers von Glutamat auf das Coenzym der Aspartat-Aminotransferase während der Transaminierungsreaktion

Während der Transaminierungsreaktion der mitochondrialen Aspartat-Aminotransferase wurde der Transfer von Tritium von der Alpha-Position von Glutamat zur pro-S-Position von C4' von Pyridoxamin-5'-phosphat nachgewiesen. Ein schnelles Misch- und Quench-Gerät musste verwendet werden, um die Anzahl der Transaminierungszyklen, die das Enzym durchlief, zu verringern und damit den begleitenden Austausch des Labels mit Wasser zu minimieren. Das Ausmaß des Transfers des Labels (Mittelwert 1,5%; Bereich 0,8-4%) deutet darauf hin, dass der 1,3-prototrope Shift einem schrittweisen, anstatt einem konzertierten Mechanismus folgt und dass eine einzelne Säure/Base-Gruppe für den Protonentransfer verantwortlich ist. Das tatsächliche Ausmaß des Protonentransfers muss viel höher sein, da die Rate des Alpha-Tritium-Austauschs mit dem Lösungsmittel nur etwa 10% der Umsatzrate des unlabeled Substrats betrug, was entweder einen Isotopeffekt oder eine Retention des Tritium-Labels im Reaktionszentrum während der Tautomerisierung widerspiegelt. Unter der Annahme eines Isotopeffekts kann der tatsächliche Transfer auf 13% geschätzt werden. Dieser Wert ist konsistent mit der Vorstellung, dass Lys-258 als Protonübertragungsgruppe wirkt, in welchem Fall der maximale Transferwert in einem aktiven Zentrum, das während des 1,3-prototropen Shifts nicht für das Lösungsmittel zugänglich ist, 33% betragen würde. Alternative Mechanismen, die Tyr-70 oder ein Wassermolekül, das als Säure/Base-Gruppe im aktiven Zentrum eingeschlossen ist, beinhalten, können jedoch auf der Grundlage der gegenwärtigen Ergebnisse nicht ausgeschlossen werden. Darüber hinaus wurde in diesen Untersuchungen auch festgestellt, dass die Aspartat-Aminotransferase den Austausch von Tritium von der Beta-Position von Glutamat katalysiert, jedoch mit einer Rate, die 350-mal langsamer ist als die der Alpha-Austausch.