Ein optimiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus kleinen Abschnitten von lasergefangenen mikrodissezierten FFPE-Gewebe für die nächste Generation von Sequenzierungen

HINTERGRUND: Formalin-fixiertes paraffingebettetes (FFPE) Gewebe stellt einen umfangreichen Schatz an Proben für die biomedizinische Forschung dar. Bislang war die Extraktion von RNA aus FFPE-Gewebe jedoch herausfordernd, da chemische RNA-Protein-Quervernetzungen und RNA-Fragmente die RNA-Quantität und -Qualität für nachgelagerte Analysen stark beeinflussen. Bei sehr kleinen Proben, z.B. bei der Durchführung von Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) zur Isolation spezifischer Zellunterpopulationen, wird die Rückgewinnung ausreichender RNA für Analysen mit reverser Transkriptions-qPCR (RT-qPCR) oder der nächsten Generation von Sequenzierungen (NGS) sehr mühsam und schwierig. METHODEN: Wir schnitten passende krebsassoziierte Stroma (CAS) und normales Stroma aus klinischen Proben von FFPE-hundlichen Mammatumoren mit LCM heraus und verglichen das gängige proteasebasierte RNA-Isolationsverfahren mit einer angepassten neuen Technik, die zusätzlich einen fokussierten Ultraschallschritt beinhaltet. ERGEBNISSE: Wir haben erfolgreich ein Protokoll angepasst, das fokussierten Ultraschall verwendet, um RNA aus kleinen Mengen von deparaffinisierten, gefärbten klinischen LCM-Proben zu isolieren. Mit diesem Ansatz fanden wir heraus, dass die Gesamtausbeuten an RNA um das 8- bis 12-Fache im Vergleich zu einer gängigen proteasebasierten Extraktionsmethode erhöht werden konnten. Überraschenderweise war die mit diesem neuen Ansatz extrahierte RNA qualitativ mindestens ebenso gut, wenn nicht sogar überlegen, im Vergleich zum alten Ansatz, da die Cq-Werte in der RT-qPCR im Durchschnitt 2,3-fach niedriger waren, wenn die neue Methode verwendet wurde. Schließlich zeigen wir, dass die mit der neuen Methode extrahierte RNA auch in NGS vergleichbar abschneidet. SCHLUSSFOLGERUNGEN: Wir präsentieren ein erfolgreiches Isolierungsprotokoll für die Extraktion von RNA aus schwierigen und limitierenden FFPE-Gewebeproben, das eine erfolgreiche Analyse kleiner Abschnitte aus klinisch relevanten Proben ermöglicht. Die Möglichkeit, Gene exprimierende Signaturen in spezifischen kleinen Abschnitten von Archiv-FFPE-Gewebe zu untersuchen, die oft große Mengen hochrelevanter klinischer Follow-up-Daten mit sich bringen, öffnet eine neue Dimension für bisher schwer zu analysierende Proben, die nun für Untersuchungen zugänglich werden.