Entwicklung einer quantitativen Methode zur Messung der EV-Aufnahme

Das herausragende Potenzial von Extrazellulären Vesikeln (EVs) in der Medizin erfordert eine detaillierte Untersuchung der molekularen Aspekte, die ihre Integration in Zielzellen regulieren. Da die Größe der EVs jedoch unter der Auflösungsgrenze optischer Techniken liegt, wird die Quantifizierung sowie die Unterscheidung zwischen EV-Bindung an die Zielzelle und deren Aufnahme mit den aktuellen Techniken meist nicht vollständig erreicht. Menschliche Tetraspanine CD9 und CD63 wurden mit einem dualen EGFP-Renilla-split Tag fusioniert. Die subzelluläre Lokalisation und Incorporation dieser Fusionsproteine in EVs wurde durch Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie bewertet. Die EV-Bindung und -Aufnahme wurde entweder mit einem klassischen Renilla-Substrat oder einem zytopermeablen Substrat gemessen. Die Inkubation von Zielzellen, die DSP2 exprimieren, mit EVs, die den komplementären DSP1-Anteil enthalten, konnte keine Fluoreszenz oder Luciferase-Aktivität zurückgewinnen. Allerdings konnten wir, indem wir EVs verwendeten, die das vollständig reconstitutierte Dual-EGFP-Renilla-Protein und das zytopermeable Renilla-Luziferase-Substrat trugen, zwischen EV-Bindung und -Aufnahme unterscheiden. Wir liefern den Beweis für das Konzept des Systems, indem wir den Effekt verschiedener chemischer Inhibitoren analysieren, und zeigen, dass diese Methode hochsensitiv und quantitativ ist, wodurch eine dynamische Nachverfolgung in einem Hochdurchsatz-Schema ermöglicht wird, um die molekularen Mechanismen der EV-Aufnahme in verschiedenen biologischen Systemen aufzudecken.