PixFRET, ein ImageJ-Plug-in zur FRET-Berechnung, das Variationen in spektralen Überlappungen berücksichtigen kann

Die Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) ermöglicht es dem Benutzer, Wechselwirkungen zwischen fluoreszierenden Partnern zu untersuchen. Ein entscheidendes Problem bei der Berechnung der sensibilisierten Emission FRET ist die Korrektur für spektrale Überlappungen (SBTs), die die Berechnung der Verhältnisse zwischen den Intensitäten in den FRET- und den Donor- oder Akzeptoreinstellungen erfordert, wenn nur der Donor oder der Akzeptor vorhanden ist. Theoretisch sollten SBT-Verhältnisse konstant sein. Experimentell können diese Verhältnisse jedoch in Abhängigkeit von der Fluorophorintensität variieren, und die Annahme konstanter Werte kann eine präzise FRET-Berechnung behindern. Eine mögliche Ursache für eine solche Variation ist die Verwendung eines Mikroskopaufbaus mit unterschiedlichen Photomultipliern für die Donor- und FRET-Kanäle, einem Aufbau, der schnellere Aufnahmen von sehr dynamischen fluoreszierenden Molekülen in lebenden Zellen ermöglicht. Hier zeigen wir, dass die durch die differentielle Reaktion der beiden PMTs eingeführte Verzerrung durch ein einfaches Modellieren der SBT-Verhältnisse in Abhängigkeit von der Fluorophorintensität umgangen werden kann. Ein weiteres wichtiges Thema bei der Durchführung von FRET ist die Lokalisierung von FRET innerhalb der Zelle oder einer Zellpopulation. Daher haben wir ein kostenlos verfügbares ImageJ-Plug-in namens PixFRET entwickelt, das eine einfache und rasche Bestimmung der SBT-Parameter und die Anzeige von normalisierten FRET-Bildern ermöglicht. Der Nutzen dieses Modells und des Plug-ins wird durch die Untersuchung von FRET in einem System veranschaulicht, in dem zwei interagierende nukleäre Rezeptoren, die mit ECFP und EYFP markiert sind, in lebenden Zellen co-exprimiert werden.