Glycosylierung von strukturierten Proteindomänen in zellfreien Reaktionsumgebungen

Die Produktion von N-verknüpften Glykoproteinen in genetisch handhabbaren bakteriellen Wirten und deren zellfreien Extrakten birgt großes Potenzial für kostengünstige, anpassbare und verteilte Bioproduktion von Glykokonjugatimpfstoffen und Glykoprotein-Therapeutika. In nahezu allen bisher beschriebenen bakteriellen N-verknüpften Protein-Glycosylierungssystemen wird ein einfaches zweites transmembranäres Oligosaccharid-Transferase (OST) eingesetzt, das Akzeptorstellen in flexiblen, lösungsmittel-exponierten Motiven des Glykoprotein-Substrats bevorzugt. Trotz dieser Präferenz können jedoch auch Akzeptorstellen in strukturierten Domänen in lebenden Bakterien glycosyliert werden, vermutlich durch einen Mechanismus, bei dem die Stelle dem OST in flexibler Form während oder nach dem Membrantranslokationsschritt, aber vor Abschluss der Faltung, präsentiert wird. Während die N-Glykoprotein-Biosynthese auch unter Verwendung von zellfreien Extrakten, die aus glycosylierungsfähigen Bakterien gewonnen werden, durchgeführt werden kann, bleibt festzustellen, ob die zellfreie Reaktionsumgebung einen ähnlichen Mechanismus für die Glycosylierung strukturierter Domänen beinhaltet. Mit einem auf Escherichia coli basierenden zellfreien Glykoprotein-Synthesesystem (CFGpS) beobachteten wir eine effiziente Glycosylierung von zwei eukaryotischen Glykoproteinen, nämlich Ribonuklease A (RNase A) und dem fragmentkristallisierbaren (Fc) Bereich von humanem Immunglobulin G (IgG), dessen Akzeptorstellen in strukturell eingeschränkten Bereichen auftreten, die nicht glycosyliert wurden, als die Proteine bereits gefaltet waren. Da diese zellfreie Glycosylierung von ribosomaler Translation abhing, aber nicht von der signalpeptidvermittelten Translokation, schlagen wir die Existenz eines einzigartigen co-translationalen, jedoch nicht co-translokalen Glycosylierungsmechanismus in CFGpS vor. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse das Potenzial von CFGpS als tragfähige Plattform zur Produktion komplexer eukaryotischer Glykoproteinziele.