Charakterisierung eines thermostabilen Cas9 für die Bearbeitung und das Ausschalten bakterieller Genome

CRISPR-Cas9-basierte Genome-Engineering-Tools haben die grundlegende Forschung und die biotechnologische Nutzung von sowohl Eukaryoten als auch Prokaryoten revolutioniert. Die mesophile Natur der etablierten Cas9-Systeme erlaubt jedoch keine Anwendungen, die eine verbesserte Stabilität erfordern, einschließlich Ingenieurwesen bei erhöhten Temperaturen. Hier identifizieren und charakterisieren wir ThermoCas9 aus dem thermophilen Bakterium Geobacillus thermodenitrificans T12. Wir zeigen, dass in vitro ThermoCas9 zwischen 20 und 70 °C aktiv ist, eine strenge PAM-Präferenz bei niedrigeren Temperaturen hat, weniger Spacer-Protospacer-Mis-Matches als SpCas9 toleriert und seine Aktivität bei erhöhten Temperaturen von der sgRNA-Struktur abhängt. Wir entwickeln ThermoCas9-basierte Engineering-Tools für die Gen-Deletion und transkriptionale Stilllegung bei 55 °C in Bacillus smithii und für die Gen-Deletion bei 37 °C in Pseudomonas putida. Insgesamt bieten unsere Ergebnisse grundlegende Einblicke in ein thermophiles CRISPR-Cas-F Mitglied und etablieren ein Cas9-basiertes Tool zur Bearbeitung und Stilllegung bakterieller Genome mit einem breiten Temperaturbereich.