Fluoreszenz-aktivierende und Absorptionsverschiebende Tags für fortgeschrittene Bildgebung und Biosensorik

Zusammenfassung: Fluoreszierende Etiketten und Biosensoren spielen zentrale Rollen in der biologischen und medizinischen Forschung. Zielgerichtet auf spezifische Biomoleküle oder Zellen ermöglichen sie die nicht-invasive Bildgebung der Mechanismen, die Zellen und Organismen in Echtzeit steuern. Kürzlich haben chemogenetische Reporter aus organischen Farbstoffen, die spezifisch an genetische Tags verankert sind, das Paradigma vollständig genetisch kodierter fluoreszierender Proteine in Frage gestellt. Durch die Kombination der Vorteile synthetischer Fluorophore mit der Zielgenauigkeit genetisch kodierter Tags eröffnen diese chemogenetischen Reporter aufregende Perspektiven für die Untersuchung der Zellbiochemie und Biologie. In diesem Bericht stellen wir das wachsende Werkzeugset der fluoreszenzaktivierenden und absorptionsverschiebenden Tags (FASTs) vor, kleine monomere Proteine von 14 kDa (125 Aminosäurereste), die als Marker verwendet werden können, um die Genexpression und die Proteinlokalisierung in lebenden Zellen und Organismen zu überwachen. Durch gerichtete Proteinevolution aus dem fotoaktiven gelben Protein (PYP) des Bakteriums Halorhodospira halophila entwickelt, bindet das prototypische FAST das fluoreszierende Gegenteil von lebenden zellverträglichen Hydroxybenzyliden-Rhodanin-Chromophoren und stabilisiert es. Diese Klasse von Chromophoren ist normalerweise dunkel, wenn sie frei in Lösung oder in Zellen vorliegt, da sie Lichtenergie durch nichtradiative Prozesse abbaut. Der Proteinraum von FAST ermöglicht die Stabilisierung des deprotonierten Zustands des Chromophors und blockiert das Chromophor in einer planareren Konformation, was zu hochfluoreszierenden Protein-Chromophor-Assemblies führt. Der Einsatz solcher fluorogenen Farbstoffe (auch Fluorogene genannt) ermöglicht die Bildgebung von FAST-Fusionsproteinen in Zellen mit hohem Kontrast, ohne dass ungebundene Liganden durch separate Waschschritte entfernt werden müssen. Heutzutage existieren Fluorogene mit verschiedenen spektralen Eigenschaften, die es den Wissenschaftlern ermöglichen, die spektralen Eigenschaften von FAST an ihre experimentellen Bedingungen anzupassen. Molekulare Ingenieurkunst hat es zudem ermöglicht, membranunpermeable Fluorogene für die selektive Markierung von Oberflächenproteinen zu erzeugen. Im Laufe der Jahre haben wir eine Sammlung von FAST-Varianten mit erweiterten spektralen Eigenschaften oder Fluorogen-Selektivität mithilfe einer abgestimmten Strategie aus molekularer Ingenieurkunst und gerichteter Proteinevolution erstellt. Darüber hinaus erlaubte uns die Proteiningenieurkunst, FASTs für das Design fluoreszierender Biosensoren anzupassen. Die zirkuläre Permutation ermöglichte die Erzeugung von FAST-Varianten mit erhöhter konformationaler Flexibilität für das Design von Biosensoren, bei denen die Fluorogenbindung an die Erkennung eines bestimmten Analyten gekoppelt ist. Auch die Bisection von FASTs in zwei komplementäre Fragmente erlaubte uns, gespaltete Varianten mit reversibler Komplementierung zu schaffen, die die Detektion und Bildgebung dynamischer Protein-Protein-Interaktionen ermöglichen. Hier geben wir einen allgemeinen Überblick über den aktuellen Entwicklungsstand dieser verschiedenen Systeme und deren Anwendungen für fortgeschrittene live Zellbildgebung und Biosensorik und diskutieren mögliche zukünftige Richtungen.