Einfluss verschiedener Proteinase K Verdauprotokolle und Deprafinierungsmethoden auf Ertrag und Integrität von aus formalinfestem, paraffineingebettetem Gewebe extrahierter DNA

DNA, die aus formalinfestem, paraffineingebettetem Gewebe extrahiert wird, ist oft unzureichend für die Sequenzierung, aufgrund von geringem Ertrag oder Abbau. Wir optimierten den Proteinase K Verdau, indem wir ein erhöhtes Volumen des Enzyms und eine verlängerte Verdauzeit gemäß dem Protokoll des Herstellers mit 54 Biospezimen testeten und den Verdau in Zentrifugentuben durchführten. Eine Verdopplung der Menge an Proteinase K führte zu einem medianen Ertragsanstieg von 96%. Die Anwendung des optimierten Proteinase K Protokolls auf auf Mikroskopträgern deprafinierte Schnitte führte zu einem weiteren Ertragsanstieg von 41%, jedoch nur bei >50.000 epithelialen Tumorzellen/Schnitt. Der DNA-Ertrag korrelierte nun mit (χ 2 = 0,84) und konnte aus der Anzahl der epithelialen Tumorzellen vorhergesagt werden. Die Integrität der DNA wurde mittels Endpunkt-Multiplex-PCR (Amplicons von 100–400 bp, visualisiert auf einem Gel), quantitativer PCR (qPCR; Illumina FFPE QC Assay) und Nanoelektrophorese (DNA-Integritätszahlen DINs) untersucht. Im Allgemeinen waren Ertragssteigerungen mit Steigerungen der Integrität verbunden, doch manchmal standen die Ergebnisse von qPCR und DIN in Konflikt. Amplicons von 400 bp wurden fast universell erhalten. Der Optimierungsprozess ermöglichte es uns, den Prozentsatz der Proben, die die veröffentlichten Qualitätskontrollschwellen zur Bestimmung der Eignung für die vollständige Genomsequenzierung nicht bestanden, von 33% auf 7% zu reduzieren.