CRISPR-Cas12a conçu pour des perturbations chromatiniennes combinatoires de haut ordre

Résumé Les perturbations génétiques multiplexées sont essentielles pour tester les interactions fonctionnelles entre des éléments génétiques codants ou non codants. Par rapport à la coupure de l'ADN à double brin, la formation de chromatine répressive utilisant l'interférence CRISPR (CRISPRi) évite la génotoxicité et est plus efficace pour perturber les éléments régulateurs non codants dans des essais groupés. Cependant, les approches actuelles de criblage groupé de CRISPRi sont limitées à cibler un à trois sites génomiques par cellule. Nous avons conçu une variante d'Acidaminococcus Cas12a (AsCas12a), l'interférence transcriptionnelle multiplexée AsCas12a (multiAsCas12a), qui incorpore R1226A, une mutation qui stabilise le complexe ribonucléoprotéine-ADN par le biais de coupures d'ADN. La fusion multiAsCas12a-KRAB améliore l'activité CRISPRi par rapport aux fusions AsCas12a-KRAB inactives de DNase, sauvant souvent les activités des ARN CRISPR (crRNA) livrés lentiviralement qui sont inactifs lorsqu'ils sont utilisés avec ces derniers. Le multiAsCas12a-KRAB supporte CRISPRi en utilisant des matrices crRNA à 6 plex dans des criblages groupés à haut débit. Utilisant le multiAsCas12a-KRAB, nous découvrons des éléments amplificateurs et disséquons la fonction combinatoire des éléments cis-régulateurs dans des cellules humaines. Ces résultats instaurent un cadre de test groupé pour sonder efficacement de nombreuses combinaisons de perturbations chromatiniennes pour la découverte et l'ingénierie biologiques.