Membranremodellering är avgörande för cellulära processer som endocytos, cellmigration och morfogenes, och regleras av BAR-domäninnehållande proteiner. Dessa proteiner binder till membraner genom sina böjda ytor och samordnar ofta aktinpolymerisering via interaktion med signalmolekyler. Det här examensarbetet syftade till att optimera kloning, uttryck och rening av tre F-BAR-domän innehållande proteiner—CIP4, srGAP2 och CeTOCA-1—för funktionell och strukturell analys med hjälp av liposomer och cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). Konstruktioner med olika fusionstags (GST, SUMO3-eGFP, NT*) uttrycktes i E. coli. En fosfatbuffert med hög salthalt förbättrade tydligt löslighet och utbyte av CIP4 NT*, även om viss heterogenitet återstod. Cryo-EM visade att CIP4 WT, men inte CIP4 NT*, bildade membrantubuli, vilket tyder på att NT*-taggen kan hämma förmågan att deformera membran. srGAP2:s F-BAR-domän, som funktionellt beter sig som en I-BAR-domän genom att inducera utåtriktad kurvatur, band starkt till liposomer men gav inga tolkbara cryo-EM-bilder, troligen på grund av instabilitet efter proteasklyvning. CeTOCA-1:s SH3-domän renades framgångsrikt och är redo för framtida interaktionsstudier. Utveckling av cirkulära nanodiscar föreslås som ett nästa steg för att studera BAR-proteiner i mer naturliga membranmiljöer. Studien belyser de utmaningar som är förknippade med arbete på BAR-domänproteiner och vikten av optimerade strategier för uttryck och rening i strukturella studier.
Ebba Rosberg (Wed,) studied this question.