Effects of natural endocrine active substances on tight junction expression in the intestinal epithelium modeled with Caco-2/HT29-MTX-E12 co-culture

Eine unzureichende Barrierefunktion des Darmtraktes ist ein relevanter ätiologischer Faktor für die Entstehung verschiedener Krankheiten wie entzündliche Darmerkrankungen und Darmkrebs im Menschen. Unter physiologischen Bedingungen reguliert die Darmbarriere effektiv den Transport von Nährstoffen und Wasser sowie schützt vor potenziell schädlichen in der Nahrung vorkommenden Substanzen. Intestinale Epithelzellen sind durch spezialisierte Proteine stark miteinander verbunden, den sogenannten Tight Junctions. Tight Junctions verbinden nicht nur Epithelzellen miteinander, sondern regulieren auch den parazellulären Transport von Nahrungsbestandteilen und haben daher einen starken Einfluss auf die Barrierefunktion des Darms. Die Forschung legt nahe, dass verschiedene Substanzen in der Nahrung die Barrierefunktion des Darms verändern können, indem sie die Expression integraler Membranbestandteile so wie Tight Junction Proteine beeinflussen. Aktuelle Studien weisen darauf hin, dass endokrin-aktive Chemikalien (EAC) oder endokrine Disruptoren (EDC) die Expression von claudin 4 (CLDN4) und anderen Membranproteinen verändern können. Die hier vorliegende Masterarbeit beleuchtet den Effekt ausgewählter natürlich vorkommender EACs auf das Tight Junction Protein CLDN4. Die getesteten natürlichen EACs beinhalten die Phytoöstrogene Genistein (GEN), Daidzein (DAI), Chrysin (CHRY), das Mykoöstrogen Zearalenon (ZEN) und die endogenen Substanzen 17β-Estradiol (E2) und Cholesterol (CHOL). Phytoöstrogene kommen natürlicherweise in Pflanzen vor und sind häufige Bestandteile der Nahrung. Durch ihre strukturelle Ähnlichkeit zu 17β-Estradiol verfügen sie über östrogene Aktivität. Mykoöstrogene sind auch endokrin-aktiv und werden über pilzbefallenes Getreide konsumiert. Das Darmepithel wurde durch ein Kokultur aus Caco-2 und Mukus produzierenden HT29-MTX-E12 Zellen modelliert. Nach 7 Tagen Differenzierungszeit, bildet die Kokultur eine einschichtige Zelllage mit Mukus. Um Effekte abzuschätzen, die bei Erkrankungen mit geschädigter Schleimhaut im Darm, wie dem Reizdarmsyndrom, auftreten, wurden auch Untersuchungen mit reduziertem Mukus durchgeführt. Nach 24-stündiger Inkubation der Kokultur mit den gewählten Substanzen wurde CDLN4 mit Antikörper markiert. Konfokal Mikroskopie (63X) ermöglichte eine detaillierte Bestimmung des CLDN4 Proteins. Interessanterweise hatten die Substanzen CHRY, CHOL und E2 einen starken Effekt auf die CLDN4 Expression in dem hier verwendeten Modell. Weiters wurde der Einfluss der Testsubstanzen auf die Membranfluidität untersucht, da ein möglicher Zusammenhang zwischen Membranzusammensetzung und Funktion der Membranproteine besteht. Zusätzlich wurde Deoxynivalenol (DON), eine weitere Substanz mit potenziellen Auswirkungen auf die Barrierefunktion, als Referenzsubstanz untersucht, um die Beobachtungen mit einer nicht endokrin-aktiven natürlichen Kontaminante zu untermauern. Inkubation mit DON führte zu einer erhöhten CLDN4 Expression in der 7-Tage differenzierten Kokultur.