Méthode Waffle : Une approche générale et flexible pour améliorer le débit dans le fraisage FIB

Le Cryo-FIB/SEM combiné à la cryo-ET a émergé dans le domaine de la cryo-EM comme la méthode permettant d'obtenir les informations structurales les plus résolues sur des échantillons biologiques complexes in situ dans des environnements natifs et non natifs. Cependant, des défis persistent dans les workflows conventionnels de Cryo-FIB/SEM, y compris le fraisage d'échantillons épais avec des problèmes de vitrification, d'échantillons avec une orientation préférentielle, un faible débit lors du fraisage d'échantillons petits et/ou de basse concentration, et d'échantillons qui se répartissent mal sur les carrés de la grille. Ici, nous présentons une approche générale appelée 'Méthode Waffle' qui tire parti du congélation sous haute pression pour relever ces défis. Nous illustrons l'atténuation de ces défis en appliquant la Méthode Waffle et la cryo-ET pour révéler la macrostructure du tube polaire dans des spores de microsporidies dans plusieurs orientations complémentaires, ce qui n'était auparavant pas possible en raison de l'orientation préférentielle. Nous démontrons l'ampleur de la Méthode Waffle en l'appliquant à trois échantillons cellulaires supplémentaires et un échantillon de particules unique en utilisant une variété de matériels de fraisage cryo-FIB, avec des approches manuelles et automatisées. Nous présentons également un espace de soulagement du stress unique et critique conçu spécifiquement pour les lamelles gaufrées. Nous proposons la Méthode Waffle comme un moyen d'atteindre de nombreux avantages du cryo-liftout sur la grille d'échantillons tout en évitant le processus long, difficile et techniquement exigeant requis pour le cryo-liftout.