Systèmes de suppression de nonsense mutuellement orthogonaux et chimies de conjugaison pour un marquage précis des protéines à jusqu'à trois sites distincts

L'incorporation spécifique de sites de multiples acides aminés non canoniques distincts (ncAAs) dans une protéine est une technologie émergente avec un potentiel énorme. Elle repose sur des paires d'acyl-tRNA synthétase/tRNA ingénieries mutuellement orthogonales qui suppriment différents codons de nonsense/décalage de cadre. Jusqu'à présent, jusqu'à deux ncAAs distincts ont été intégrés dans des protéines exprimées dans E. coli, en utilisant des paires de tyrosyl et de pyrrolysyl dérivées des archées. Ici, nous rapportons que la paire de tryptophanyl dérivée d'E. coli peut être combinée avec la paire de tyrosyl archéale ou la paire de pyrrolysyl dans E. coli ATMW1 pour incorporer deux ncAAs différents dans une protéine avec une grande fidélité et efficacité. En combinant les trois paires orthogonales, nous montrons également l'incorporation simultanée spécifique de sites de trois ncAAs différents dans une seule protéine. Pour utiliser cette technologie pour le marquage chimiosélectif des protéines avec plusieurs entités distinctes à des sites prédéfinis, nous avons également cherché à identifier différents poignées de bioconjugaison qui peuvent être co-incorporées dans des protéines comme chaînes latérales de ncAA et ensuite fonctionnalisées par des chimies de marquage mutuellement compatibles. À cette fin, nous montrons que la réaction de couplage azo-rapide chimiocatalytique (CRACR) récemment développée dirigée vers 5-hydroxytryptophane (5HTP) est compatible avec l'addition cycloaddition azide-alkyne promue par contrainte (SPAAC) ciblée sur p-azidophénylalanine (pAzF) et l'addition cycloaddition Diels-Alder inverse de demande d'électrons promue par contrainte (SPIEDAC) ciblée sur cyclopropène-lysine (CpK) pour un marquage rapide et sans catalyseur des protéines à plusieurs sites. En combinant ces systèmes de suppression de nonsense mutuellement orthogonaux et les poignées de bioconjugaison mutuellement compatibles qu'ils incorporent, nous montrons le marquage spécifique de sites de protéines exprimées recombinamment à jusqu'à trois sites distincts.