Un lien disulfure ingénieré dans la dihydrofolate réductase

La substitution de cystéine pour proline-39 dans la dihydrofolate réductase d'Escherichia coli par mutagénèse dirigée par oligonucléotides positionne la nouvelle cystéine adjacente à la cystéine-85 déjà existante. Lorsque la protéine mutante est exprimée dans le cytosol d'E. coli, les atomes de soufre de cystéine se trouvent, par analyse cristallographique aux rayons X, en contact de van der Waals mais pas liés de manière covalente. L'oxydation in vitro par dithionitrobenzoate mène à la formation d'un lien disulfure entre les résidus 39 et 85 avec une géométrie proche de celle de la spirale gauche couramment observée. La comparaison des structures cristallines affinées à 2,0 Å des formes oxydées (réticulées) et réduites (non-réticulées) de l'enzyme mutante montre que la conformation de la molecule d'enzyme n'a pas été sensiblement affectée par la formation du lien disulfure mais que les détails du mouvement thermique de la molécule ont été modifiés. L'enzyme liée par disulfure est au moins 1,8 kcal/mol plus stable par rapport au dépliement, mesuré par la dénaturation par chlorhydrate de guanidine, que l'enzyme sauvage ou l'enzyme mutante réduite (non-réticulée). Néanmoins, la forme réticulée n'est pas plus résistante à la dénaturation thermique. De plus, l'apparition d'intermédiaires dans le profil de dénaturation par chlorhydrate de guanidine et dans les gels de polyacrylamide en gradient d'urée indique que le chemin de repliement/dépliement de l'enzyme liée par disulfure a changé de manière significative.