Ingénierie des biocatalyseurs pour l'activation C−H des acides gras par reconstruction de séquence ancestrale**

L'activation C-H sélective, en une étape, des acides gras à partir de biomasse est un concept attractif en chimie durable. La biocatalyse a montré des perspectives prometteuses pour générer des acides hydroxyles de haute valeur, mais jusqu'à présent, la découverte d'enzymes a reposé sur un criblage laborieux et a produit des résultats limités, qui oxydent principalement les positions subterminales des acides gras. Ici, nous montrons que la reconstruction de séquence ancestrale (ASR) est un outil efficace pour explorer le paysage séquence-activité d'une famille de monooxygénases P450 multidomaines et autonomes. Nous avons ressuscité 11 ancêtres catalytiquement actifs CYP116B, chacun avec une empreinte de régiosélectivité unique variant de subterminal chez les ancêtres plus anciens à chaîne intermédiaire dans la lignée menant aux P450 modernes. Dans les lignées menant aux enzymes actuelles chez les thermophiles, la thermostabilité a augmenté des formes ancestrales aux formes modernes, comme attendu si la thermophilie était née de novo. Nos études montrent que l'ASR peut être appliquée à des enzymes multidomaines pour développer des monooxygénases actives et autonomes en tant que biocatalyseurs régiosélectifs pour l'hydroxylation des acides gras.