Développement et optimisation des méthodes de séquençage de nouvelle génération métagénomique pour le diagnostic du liquide céphalorachidien

L'objectif de cette étude était de développer et d'optimiser différentes méthodes de traitement, d'extraction, d'amplification et de séquençage pour le séquençage de nouvelle génération métagénomique (mNGS) d'échantillons de liquide céphalorachidien (LCR). Nous avons appliqué le mNGS à 10 échantillons de LCR avec des résultats de tests standard de soins (SoC) connus (8 positifs et 2 négatifs). Chaque échantillon a été soumis à neuf méthodes différentes en faisant varier les protocoles de traitement des échantillons (supernatant, culot, LCR pur), le prétraitement des échantillons (avec ou sans battement de billes) et l'exigence des étapes d'amplification des acides nucléiques utilisant des méthodes de séquençage ADN (DNASeq) (avec ou sans amplification du génome entier WGA) et séquençage ARN (RNASeq). Des contrôles d'extraction négatifs (NECs) ont été utilisés pour chaque variation de méthode (4/échantillon de LCR). Une déplétion hôte (HD) a été réalisée sur un sous-ensemble d'échantillons. Nous avons correctement déterminé le pathogène dans 7 des 8 échantillons positifs par mNGS par rapport à SoC. Les deux échantillons négatifs ont été correctement interprétés comme négatifs. Le protocole de traitement appliqué aux échantillons de LCR pur a été trouvé comme la technique la plus réussie pour tous les types de pathogènes. Bien que le battement de billes ait introduit un biais, nous avons constaté qu'il augmentait le rendement de détection de certains groupes d'organismes. L'amplification du génome entier avant le DNASeq était bénéfique pour définir les pathogènes au seuil positif, et une approche combinée ADN et ARN a donné des résultats avec une confiance plus élevée lorsqu'elle était détectée par les deux méthodes. La HD était nécessaire pour la détection d'un échantillon d'entérovirus à faible niveau positif. Nous démontrons que les NECs sont nécessaires pour l'interprétation de ces résultats complexes et qu'il est important de comprendre les contaminants courants introduits lors du mNGS. L'optimisation du mNGS nécessite l'utilisation d'une combinaison de techniques pour atteindre l'approche la plus sensible et agnostique qui peut néanmoins être moins sensible que les outils de SoC.