Étiquette de liaison au phosphate, un nouvel outil pour visualiser les protéines phosphorylées

Nous introduisons deux méthodes pour la visualisation des protéines phosphorylées utilisant des complexes de métaux dinucléaires bridés par alkoxy (c.-à-d. Zn(2+) ou Mn(2+)) comme nouvelles molécules d'étiquette de liaison au phosphate (Phos-tag). Les molécules d'étiquette Zn(2+)-Phos-tag et Mn(2+)-Phos-tag capturent préférentiellement les dianions de phosphomonoester liés aux résidus de Ser, Thr et Tyr. Une méthode repose sur un système d'ECL utilisant un Phos-tag de Zn(2+) en pendule de biotine et de la streptavidine conjuguée à la peroxydase de radis. Nous démontrons les analyses par électrotransfert des états de phosphorylation des protéines grâce aux signaux ECL sélectifs pour les phosphates. Une autre méthode repose sur le déplacement de mobilité des protéines phosphorylées en SDS-PAGE avec un Mn(2+)-Phos-tag lié au polyacrylamide. Les protéines phosphorylées dans le gel sont visualisées comme des bandes de migration plus lentes par rapport aux protéines déphosphorylées correspondantes. Nous démontrons les essais de kinase et de phosphatase par électrophorèse d'affinité au phosphate (SDS-PAGE avec Mn(2+)-Phos-tag).