Suivi in vivo des plaquettes : les plaquettes dégranulées circulantes perdent rapidement la P-sélectine de surface mais continuent à circuler et à fonctionner.

Pour examiner l'hypothèse selon laquelle les plaquettes positives pour la P-sélectine en surface (dégranulées) sont rapidement éliminées de la circulation, nous avons développé de nouvelles méthodes de suivi des plaquettes et de mesure de la fonction plaquettaire in vivo. Les plaquettes lavées préparées à partir de primates non humains (babouins) ont été marquées avec PKH2 (un colorant fluorescent lipophile), activées par la thrombine, lavées et réinfusées dans les mêmes babouins. La cytométrie en flux sur sang total à trois couleurs a été utilisée pour (i) identifier les plaquettes avec un anticorps monoclonal dirigé contre la glycoprotéine (GP)IIb-IIIa (intégrine alpha 11b beta 3), (ii) distinguer les plaquettes infusées par leur fluorescence PKH2, et (iii) analyser la fonction plaquettaire avec des anticorps monoclonaux. Deux heures après l'infusion de plaquettes autologues activées par la thrombine (positives pour la P-sélectine, marquées PKH2), 95 +/- 1 % (moyenne +/- SEM, n = 5) des plaquettes marquées PKH2 circulantes étaient devenues négatives pour la P-sélectine. Comparé aux plaquettes non activées par la thrombine avant l'infusion, la récupération de ces plaquettes circulantes marquées PKH2 et négatives pour la P-sélectine était similaire 24 h après l'infusion et seulement légèrement inférieure 48 h après l'infusion. La perte de la P-sélectine de surface des plaquettes était entièrement expliquée par une augmentation de 67,1 +/- 16,7 ng/ml de la concentration plasmatique de P-sélectine soluble. Les plaquettes circulantes marquées PKH2 et négatives pour la P-sélectine étaient encore capables de fonctionner in vivo, comme le démontre leur (i) participation à des agrégats plaquettaires émergeant d'une plaie de temps de saignement, (ii) liaison au Dacron dans un shunt artérioveineux, (iii) liaison de l'anticorps monoclonal PAC1 (dirigé contre le site de liaison du fibrinogène sur GPIIb-IIIa), et (iv) génération de microparticules dérivées des plaquettes procoagulantes. En résumé, (i) les plaquettes dégranulées circulantes perdent rapidement la P-sélectine de surface vers le pool plasmatique, mais continuent à circuler et à fonctionner ; et (ii) nous avons développé de nouvelles méthodes de cytométrie en flux sur sang total à trois couleurs pour le suivi des plaquettes et la mesure de la fonction plaquettaire in vivo.