Le système no-SCAR (recombineering assisté par Cas9 sans cicatrice) pour l'édition du génome dans Escherichia coli

Les méthodes d'ingénierie génomique dans E. coli permettent des manipulations faciles du chromosome in vivo avec l'aide du système de recombinase λ-Red. Ces méthodes reposent généralement sur l'insertion d'un cassette de résistance aux antibiotiques suivie de l'élimination de cette même cassette, ce qui donne lieu à une procédure en deux étapes pour les manipulations génomiques. Ici, nous décrivons une méthode et un système de plasmide qui peuvent éditer le génome d'E. coli sans marqueurs chromosomiques. Ce système, connu sous le nom de Recombineering Assisté par Cas9 sans cicatrice (no-SCAR), utilise λ-Red pour faciliter l'intégration génomique de l'ADN donneur et la coupure d'ADN double brin par Cas9 pour contre-sélectionner contre les cellules de type sauvage. Nous montrons que des mutations ponctuelles, des suppressions de gènes et des insertions de courtes séquences ont été effectuées de manière efficace dans plusieurs loci génomiques en une seule étape concernant le chromosome et n'ont laissé aucun site de cicatrice. Le plasmide d'ARN guide unique peut être facilement éliminé en raison de son origine de réplication sensible à la température, permettant des manipulations chromosomiques itératives de la même souche, comme cela est souvent requis dans l'ingénierie métabolique. De plus, nous démontrons la capacité à éliminer efficacement le deuxième plasmide dans le système en ciblant avec Cas9, laissant les cellules sans plasmide.