Coordination des étapes initiales de la réparation par excision de bases

Les glycosylases de l'ADN initient la réparation par excision de bases en enlevant des bases endommagées ou mal appariées, produisant de l'ADN apurinique/apyrimidinique (AP). Pour de nombreuses glycosylases, l'ADN-AP reste fortement fixé, empêchant le renouvellement enzymatique. Un exemple marquant est la glycosylase de l'ADN thymine (TDG), qui enlève la T des appariements G.T et reconnaît d'autres lésions, avec spécificité pour les dommages aux dinucléotides CpG. Le renouvellement de TDG est très lent ; son activité semble atteindre un plateau à mesure que le rapport produit/enzyme approche l'unité. L'enzyme de réparation par excision de bases suivante, l'AP endonucléase 1 (APE1), stimule le renouvellement de TDG et d'autres glycosylases, impliquant un mécanisme qui reste largement inconnu. Nous avons examiné l'activité catalytique de la TDG humaine (hTDG), seule et avec l'APE1 humaine (hAPE1), en utilisant la cinétique d'état pré-stable et un essai de fluorescence à enzyme couplée (hTDG-hAPE1). Le renouvellement de hTDG est extrêmement lent pour les substrats G.T (k(cat)=0.00034 min(-1)) et G.U (k(cat)=0.005 min(-1)), beaucoup plus lent que k(max) des expériences à turnover unique, confirmant que la libération de l'ADN-AP est limitante. Nous trouvons des différences inattendues et importantes dans k(cat) pour les substrats G.T, G.U, et G.FU, indiquant que la base excisée reste piégée dans le complexe produit par l'ADN-AP. hAPE1 augmente le renouvellement de hTDG de 42 et 26 fois pour les substrats G.T et G.U, la première mesure quantitative de l'effet de hAPE1. hAPE1 stimule hTDG en perturbant le complexe produit plutôt qu'en épuisant (endonucléolytiquement) l'ADN-AP. L'amélioration est plus grande pour le noyau catalytique de hTDG (résidus 111-308 sur 410), indiquant que les domaines N- et C-terminaux sont dispensables pour les interactions stimulatrices avec hAPE1. Des mécanismes potentiels pour la perturbation par hAPE1 du complexe produit de hTDG sont discutés.