Détection et caractérisation du produit de l'hydroéthidine et du superoxyde par HPLC et limitations de la fluorescence

Ici, nous rapportons la caractérisation structurelle du produit formé par la réaction entre l'hydroéthidine (HE) et le superoxyde (O₂^{-}). En utilisant des techniques de spectrométrie de masse et de RMN, la structure chimique de ce produit a été déterminée comme étant de l'hydroxyéthidium (2-OH-E +). En utilisant un étalon authentique, nous avons développé une approche HPLC pour détecter et quantifier le produit de réaction de HE et O₂^{-} formé dans des cellules endothéliales aortiques bovines après traitement avec la ménadione ou l'antimycin A pour induire des espèces réactives de l'oxygène intracellulaires. Concomitamment, nous avons utilisé un piège à spin, le 5-tert-butoxycarbonyle-5-méthyl-1-pyrroline N-oxyde (BMPO), pour détecter et identifier la structure des espèces réactives de l'oxygène formées. BMPO a piégé le O₂^{-} qui s'est formé extracellulairement et a été détecté comme l'adduit BMPO-OH lors de l'utilisation de la technique EPR. Étant perméable aux cellules, BMPO a inhibé la formation intracellulaire de 2-OH-E +. Cependant, l'adduit de spin BMPO intracellulaire n'a pas été détecté. La caractérisation définitive du produit de réaction du O₂^{-} avec HE décrite ici constitue la base d'un essai sans ambiguïté pour la détection et la quantification intracellulaires du O₂^{-}. L'analyse des caractéristiques de fluorescence de l'éthidium (E +) et de 2-OH-E + suggère fortement que la méthodologie de fluorescence actuellement disponible n'est pas adaptée pour quantifier le O₂^{-} intracellulaire. Nous conclurons que l'essai HPLC/fluorescence utilisant HE comme sonde est plus approprié pour détecter les espèces réactives de l'oxygène intracellulaires O₂^{-}.