Mécanisme de la réaction catalysée par la décarboxylase de l'acétoacétate. Importance de la lysine 116 dans la détermination du pKa de la lysine 115

La décarboxylase de l'acétoacétate de Clostridium acetobutylicum (AAD) catalyse la décarboxylation de l'acétoacétate via un intermédiaire de base de Schiff Hamilton, G. A., Fridovich, I., Frey, P. A., Kokesh, F. C., Schmidt, D. E., Jr., & Westheimer, F. H. (1971) Biochemistry 10, 1249. Westheimer et ses collaborateurs ont émis l'hypothèse que le pKa de la Lys 115 est diminué par sa proximité spatiale avec le groupe epsilon-ammonium de la Lys 116. Nous avons étudié cette proposition en examinant des mutants orientés de la Lys 115 et de la Lys 116. Deux substitutions pour la Lys 115 (K115C et K115Q) étaient toutes deux catalytiquement inactives à pH 5,95, le pH optimal de l’AAD sauvage, démontrant l'importance de ce résidu dans la catalyse. L'activité a pu être restaurée pour K115C par aminoéthylation avec le bromure d'ammonium 2-bromoéthyl (2-BEAB). Les substitutions pour la Lys 116 (K116C, K116N, et K116R) avaient des activités réduites mais significatives à pH 5,95. Les effets de la Lys 116 sur le pKa de la Lys 115 dans les AAD mutants ont été évalués après formation d'imine avec le 5-nitrosalicylaldéhyde et réduction avec NaBH4. Alors que le pKa de la Lys 115 dans K116R est similaire à celui observé pour l’AAD sauvage, les pKa de la Lys 115 dans K116C et K116N ont été élevés à > 9,2. L'alkylation de la Cys 116 dans K116C avec 2-BEAB a entraîné à la fois une activation significative et une restauration du pKa de la Lys 115 à 5,9. Ces données soutiennent l'hypothèse de Westheimer selon laquelle le pKa de la Lys 115 formant la base de Schiff est réduit par sa proximité spatiale avec le groupe epsilon-ammonium de la Lys 116.