Stabilisation de la créatinase de Pseudomonas putida par mutagénèse aléatoire

La créatinase (créatine amidinohydrolase, EC 3.5.3.3) de Pseudomonas putida est un homodimère de masse moléculaire de sous-unité de 45 kDa, dont la structure tridimensionnelle est connue à une résolution de 1,9 A. Trois mutants ponctuels, A109V, V355M et V182I, ainsi qu'un mutant double combinant A109V et V355M, et le mutant triple avec les trois substitutions, ont été comparés à la créatinase sauvage en ce qui concerne leurs propriétés physiques et enzymologiques. Les données de cristal à haute résolution pour la créatinase sauvage et les deux premiers mutants suggèrent un isomorphisme pour ces trois protéines (R. Huber, comm. pers.). Des mesures physicochimiques confirment cette prédiction, montrant que les mutations n'affectent ni la structure quaternaire ni la conformation globale ni les propriétés catalytiques par rapport à la créatinase sauvage. Le remplacement de V182 (à l'extrémité exposée au solvant de la première hélice du domaine C-terminal) ne cause pas de différences significatives par rapport à l'enzyme sauvage. Les autres mutations ponctuelles stabilisent la première étape de la transition de dénaturation biphasique sans affecter la seconde. En résumé, la stabilité accrue semble refléter de légères améliorations dans le conditionnement local sans créer de nouvelles liaisons bien définies. L'augmentation de l'hydrophobicité générée par l'introduction de groupes méthyles supplémentaires (A109V, V182I) doit être compensée par des réajustements mineurs de la structure globale. Les interactions secondaires ou quaternaires ne sont pas affectées. En passant des mutants simples aux mutants doubles et triples, à première approximation, les incréments de stabilisation sont additifs.