Plasmides promoteurs SP6 d'ADN simple brin pour l'ingénierie des ARN et des protéines mutants : synthèse d'une hormone préproparathyroïdienne « étirée »

La région intergénique du bactériophage f1 a été sous-clonée dans les plasmides promoteurs SP6, pSP64 et pSP65, dans les deux orientations. La co-infection d'E. coli avec ces plasmides chimériques promoteur SP6/bactériophage f1 et le phage résistant à l'interférence, IR1, entraîne la réplication et la sécrétion des plasmides pSP6.f1 sous forme d'ADN simple brin. Les cDNAs de préProPTH bovin, sous forme native et contenant une insertion de 117 paires de bases dans la région de codage de la protéine, ont été insérés dans ces plasmides. L'ARN transcrit à partir des constructions cDNA SP6.f1/préProPTH a été efficacement traduit dans les systèmes libres de cellules de germe de blé ou de réticulocytes sans ajout d'une coiffe 7-méthylguanosine à l'ARN. En présence de membranes microsomales pancréatiques de chien ou d'oviducte de poulet, la conversion des pré-protéines résultantes en pro-protéines a été observée. La confirmation de la cDNA préProPTH « mutée » a été déterminée par séquençage de l'ADN plasmidique simple brin avec des didéoxyribonucléotides. Ces vecteurs sont adaptés à la biosynthèse efficace de grandes quantités d'ADN simple ou double brin, et d'ARN activement traduit. Les propriétés combinées de réplication de l'ADN simple brin et du promoteur SP6 simplifient l'ingénierie des ARN mutants et de leurs protéines correspondantes. De plus, de l'ADN ou de l'ARN simple brin correspondant à l'un ou l'autre brin complémentaire peut être synthétisé en tant que sondes d'hybridation des acides nucléiques.