Isolation et caractérisation de deux kinases protéiques stimulées par des facteurs de croissance qui phosphorylent le récepteur du facteur de croissance épidermique à la thréonine 669

Une activité de kinase protéique stimulée par un facteur de croissance qui phosphoryle le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF) à Thr669 a été décrite (Countaway, J. L., Northwood, I. C., et Davis, R. J. (1989) J. Biol. Chem. 264, 10828-10835). La chromatographie par échange d'ions a démontré que cette activité de kinase protéique était attribuée à deux enzymes. Le premier pic d'activité élut du colonne correspondait à la kinase de la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2). Cependant, le second pic d'activité s'est avéré être une enzyme distincte. Nous présentons ici la purification de cette enzyme à partir de cellules tumorales humaines KB par chromatographie par échange d'ions en séquence. La kinase protéique isolée a été identifiée comme une protéine de 46 kDa par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et coloration à l'argent. La chromatographie par filtration sur gel a montré que l'enzyme était fonctionnelle dans un état monomérique. Une analyse cinétique de l'enzyme purifiée a été effectuée à 22 degrés C en utilisant un substrat peptidique synthétique basé sur la séquence primaire du récepteur EGF (KREL VEPLT669PSGEAPNQALLR). Le Km(app) pour l'ATP était de 40 +/- 5 micromolaires (moyenne +/- écart type, n = 3). L'ATP n'a pas été trouvé comme substrat pour l'enzyme purifiée. Le Km(app) pour le substrat peptidique synthétique était de 260 +/- 40 micromolaires (moyenne +/- écart type, n = 3). Le Vmax(app) pour la kinase protéique isolée a été déterminé entre 400-900 nmol/mg/min. L'enzyme purifiée a été désignée comme kinase Thr669 du récepteur EGF (ERT). Il est probable que les kinases MAP2 et ERT soient responsables de la phosphorylation du récepteur EGF à Thr669 observée dans les cellules cultivées. La stimulation marquée de l'activité kinase protéique causée par les facteurs de croissance indique que ces enzymes peuvent avoir une fonction importante lors de la transduction du signal.