Ubiquitination chimique assistée par améthylation de cystéine des histones recombinantes

L'ubiquitination des histones affecte la structure et la fonction des nucléosomes à travers des processus dynamiques réversibles étroitement régulés. La préparation efficace d'histones ubiquitinées et de leurs analogues est importante pour les études biochimiques et biophysiques sur l'ubiquitination des histones. Ici, nous rapportons la stratégie CAACU (cystéine-améthylation assistée par ubiquitination chimique) pour la synthèse efficace d'analogues d'histones ubiquitinées. L'étape clé de la stratégie CAACU est l'installation d'un dérivé 2-bromoéthylamine N-alkylé dans une histone recombinante par améthylation de cystéine, suivie d'une ligation chimique native assistée par l'auxiliaire de Seitz pour produire des analogues d'histones modifiés par mono- et diubiquitine (Ub) et un petit modificateur de type ubiquitine (SUMO). Cette approche permet la production rapide d'histones modifiées à partir de protéines recombinantes avec une expression d'environ 1,5–6 mg/L. Les liaisons isopeptidiques contenant des thioéthers dans les produits sont chimiquement stables et présentent seulement une substitution atomique dans la structure, par rapport à leurs homologues natifs. Les analogues d'histones ubiquitinées préparés par CAACU peuvent être facilement reconstitués en nucléosomes et reconnus sélectivement par les protéines interactives pertinentes. Les liaisons isopeptidiques contenant des thioéthers peuvent également être reconnues et hydrolysées par des déubiquitinases (DUBs). La cryo-microscopie électronique (cryo-EM) du nucléosome contenant H2BKC34Ub a indiqué que les histones CAACU obtenues étaient de bonne qualité pour des études structurelles. Collectivement, ce travail illustre l'utilité de la stratégie CAACU pour la production simple et efficace d'histones ubiquitinées et SUMOylées homogènes pour des études biochimiques et biophysiques.