Une méthode d'édition génomique multiplex pour Escherichia coli basée sur CRISPR-Cas12a

De nos jours, il existe plusieurs méthodes pour éditer des sites spécifiques dans le chromosome d'E. coli. Il est possible, en peu de temps, d'effectuer soit une intégration de taille de gène (~1kb) en un seul site, soit d'introduire des suppressions, de courtes insertions ou des mutations ponctuelles dans plusieurs sites. Cependant, une méthode pour intégrer rapidement plusieurs séquences de taille de gène dans différents sites n'est pas encore développée. Ici, nous décrivons une méthode et un système de plasmide pour insérer simultanément des gènes dans plusieurs loci spécifiques du génome d'E. coli sans avoir besoin de marqueurs chromosomiques. La méthode utilise un système CRISPR-Cas12a pour éliminer les cellules non modifiées par clivage de l'ADN double brin et des recombinases dérivées de phages, λ-Red, pour faciliter la recombinaison entre le chromosome et l'ADN donneur. Nous avons réussi à insérer jusqu'à 3 gènes hétérologues en un seul tour de recombinaison et de sélection. Pour démontrer l'application pratique de cette méthode d'insertion de gène, nous avons construit un E. coli recombiné à rendement élevé produisant un produit chimique utile dans l'industrie, l'acide 5-aminolévulinique (ALA). De plus, un système à deux plasmides similaire a été construit pour éditer le génome de l'extrémophile Halomonas bluephagenesis.