Les mutants de l’endo-β-N-acétylglucosaminidase de Mucor hiemalis montrent une activité de transglycosylation et de type glycosynthase améliorée

L’endo-beta-N-acétylglucosaminidase de Mucor hiemalis (Endo-M), une hydrolase glycosidique de la famille 85, agit sur la liaison beta1,4 de la partie N,N'-diacetychitobiose dans les glycanes N-liés des glycoprotéines et catalyse non seulement la réaction d'hydrolyse mais aussi la réaction de transglycosylation qui transfère la chaîne de sucre libérée à un accepteur autre que l'eau pour former une nouvelle liaison glycosidique. L'activité de transglycosylation de l'Endo-M offre de grandes promesses pour la synthèse chimio-enzymatique et le glyco-ingénierie des glycoprotéines, mais l'activité hydrolytique inhérente pour l'hydrolyse des produits et la faible transglycosylation ont freiné ses applications larges. Cet article décrit la mutagenèse dirigée par site sur des résidus dans la région catalytique putative de l'Endo-M pour générer des mutants avec une activité de transglycosylation supérieure. Deux mutants intéressants ont été découverts. Le mutant Y217F a montré une activité de transglycosylation beaucoup améliorée tout en ayant une activité hydrolytique fortement réduite par rapport à l’Endo-M sauvage. Les analyses cinétiques ont révélé que la valeur Km de Y217F pour un substrat accepteur 4-méthylumbelliféryle-beta-D-N-acétylglucosaminide était seulement un dixième de celle du type sauvage, impliquant une affinité beaucoup plus élevée de Y217F pour le substrat accepteur que le type sauvage. L'autre mutant, N175A, agit comme une glycosynthase. Il a été constaté que la mutation au niveau d'Asn175 "annulait" l'activité hydrolytique, mais le mutant était capable d'utiliser des oxazolines de sucre hautement actives (les mimétiques de l'état de transition) comme substrats donneurs pour la transglycosylation. C'est la première glycosynthase dérivée des endo-beta-N-acétylglucosaminidases qui procède via un mécanisme assisté par substrat. Nos découvertes fournissent de nouveaux aperçus sur le mécanisme assisté par substrat de GH85. L'utilité de la nouvelle glycosynthase a été exemplifiée par la synthèse efficace d'un glycopeptide du virus de l'immunodéficience humaine, type 1 (VIH-1) avec une activité anti-VIH puissante.