Quantificação aprimorada de α-sinucleína patológica em biosspecímenes de pacientes por ensaios de amplificação de sementes RT-QuIC

Agregados patológicos associados à doença de alfa-sinucleína (αSyn D) exibem disseminação semelhante a príons em sinucleinopatias, como a doença de Parkinson (DP) e a demência com corpos de Lewy (DCL). Ensaios de amplificação de sementes (EAS) como a conversão induzida por agitação em tempo real (RT-QuIC) demonstraram alta sensibilidade e especificidade diagnósticas para detectar sementes proteopáticas de αSyn D em diversos biosspecímenes de pacientes com DP e DCL. No entanto, a extensão em que as concentrações relativas de sementes proteopáticas são úteis como índices do estágio da doença ou prognóstico de um paciente permanece não resolvida. Uma característica dos atuais EAS que complica as tentativas de correlacionar os resultados dos EAS com os achados clínicos e laboratoriais de pacientes é sua imprecisão quantitativa, que normalmente tem sido limitada a discriminar grandes diferenças (por exemplo, 5–10 vezes) na concentração de sementes. Usamos ensaios de diluição em ponto final (DE) RT-QuIC para determinar as concentrações de sementes de αSyn D em biosspecímenes de pacientes e testamos a influência de várias variáveis de ensaio, como fator de diluição em série, número de réplicas e métodos de processamento de dados. O uso de fatores de diluição de 2 vezes versus 10 vezes e 12 versus 4 reações de réplica por diluição reduziu o erro do ensaio DE-RT-QuIC em até 70%. Este formato de ensaio aprimorado discriminou diferenças de apenas 2 vezes na concentração de sementes de αSyn D, além de detectar reduções de sementes de ~2-16 vezes causadas por tratamentos de inativação. Em alguns cenários, a análise dos dados usando os algoritmos de Poisson e midSIN forneceu discriminação mais consistente e estatisticamente significativa de diferentes concentrações de sementes. Aplicamos nossas estratégias de ensaio aprimoradas a múltiplos biosspecímenes de pacientes antemortem com relevância diagnóstica para DP e DCL, incluindo líquido cefalorraquidiano, pele e raspagens da mucosa olfatória. Usando DE αSyn RT-QuIC como um modelo de EAS, mostramos como melhorar significativamente a reprodutibilidade entre ensaios e a precisão quantitativa. A precisão aprimorada do EAS deve facilitar avaliações das atividades de semeadura patológicas como biomarcadores em diagnósticos e prognósticos de proteinopatias, bem como na seleção de coortes de pacientes e avaliações de farmacodinâmica e engajamento de alvos em ensaios clínicos.