Reconstitution et caractérisation de BRAF en complexe avec 14‐3‐3 et KRAS4B sur des nanodisques

Les kinases RAF sont des composants clés de la voie de signalisation RAS-MAPK, qui stimule la croissance cellulaire et est fréquemment suractivée dans le cancer. La signalisation en amont active la petite GTPase RAS, qui recrute RAF à la membrane cellulaire, entraînant une transition de ce dernier d'une conformation monomérique auto-inhibée à un dimère actif. Malgré les progrès récents, les détails mécanistiques sous-jacents à l'activation de RAF restent flous, en particulier le rôle de RAS et de la membrane dans la médiation de ce réarrangement conformationnel de RAF avec 14-3-3 pour permettre la dimérisation du domaine kinase de RAF. Ici, nous avons reconstitué un complexe actif de BRAF dimérique, un dimère de 14-3-3 et deux KRAS4B sur un bilayer de nanodisc et vérifié que son assemblage est dépendant du GTP. L'interférométrie de biolayer (BLI) a été utilisée pour comparer les affinités de liaison des complexes BRAF:14-3-3 monomériques et dimériques pour des nanodisques conjugués à KRAS4B (RAS-ND) et pour étudier les effets de la composition lipidique de la membrane et de la densité spatiale de KRAS4B sur la liaison. Le 1,2-Dioleoyl-sn-glycéro-3-phospho-L-sérine (DOPS) et une densité plus élevée de KRAS4B ont amélioré l'interaction de BRAF:14-3-3 avec RAS-ND à différents degrés selon l'état oligomérique de BRAF. Nous avons utilisé notre système reconstitué pour disséquer les effets de KRAS4B et de la membrane sur l'activité kinase des complexes BRAF:14-3-3 monomériques et dimériques, constatant que KRAS4B ou les nanodisques seuls étaient insuffisants pour stimuler l'activité, tandis que RAS-ND augmentait l'activité des deux états de BRAF. L'assemblage reconstitué de BRAF à chaîne complète avec 14-3-3 et KRAS sur un bilayer lipidique défini sans cellules offre une perspective biophysique plus holistique pour explorer la régulation de ce complexe de signalisation multimérique à la surface de la membrane.