CytK é um nanoporo biológico recém-caracterizado que estabelece estados de poro aberto estáveis com baixo desvio de base e longas durações de gravação, possibilitando medições reprodutíveis de moléculas únicas. A maioria das aplicações tem se concentrado em analitos peptídicos e proteicos, enquanto a detecção em nível de DNA permanece pouco explorada. Aqui, desenvolvemos uma estrutura para quantificar o perfil de sensoriamento interno de mutantes de CytK do tipo selvagem e engenheirados utilizando um ensaio de imobilização no qual o DNA de fita simples (ssDNA) era mantido na entrada do poro através de um laço de biotina-estreptavidina. Como referências, polióis homopoliméricos de A/C/T produziram níveis de corrente residual distintos, confirmando a leitura específica de bases sob condições imobilizadas, diferindo dos padrões observados em α-hemolisina e MspA. Para mapear as zonas de sensoriamento, construímos uma biblioteca de varredura posicional T n GGG T 22-n (0 ≤ n ≤ 22) que desloca um motivo GGG passo a passo ao longo da fita. No CytK do tipo selvagem, o perfil resultante mostrou um mínimo pronunciado próximo a n ≈ 14, identificando a zona de sensoriamento efetiva. Além disso, uma posição secundária levou a uma distribuição de corrente bimodal geral, sugerindo duas constrições luminais distintas que apoiam trabalhos previamente relatados. Estamos estendendo essa abordagem de mapeamento através de um painel de mutantes de CytK para determinar como as modificações do poro influenciam a profundidade, posição e forma da resposta de sensoriamento. Esta análise sistemática fornecerá uma base quantitativa para a engenharia e melhoria do CytK como um nanoporo tipo bloqueador para interrogação de DNA com resolução de posição sob diferentes orientações, voltagens e condições de tampão.
Wang et al. (Sun,) estudaram essa questão.
Synapse has enriched 5 closely related papers on similar clinical questions. Consider them for comparative context: