Identificación de interacciones proteína-proteína utilizando entrelazado in vivo y espectrometría de masas

La purificación de complejos proteicos se puede lograr mediante diferentes tipos de cromatografía de afinidad. En un experimento típico de inmunoafinidad, los complejos proteicos se capturan de un lysado celular mediante un anticuerpo inmovilizado que reconoce un epítopo en uno de los componentes conocidos del complejo. Después de un lavado extenso para eliminar proteínas unidas de manera no específica, los complejos se eluyen y se analizan mediante espectrometría de masas (MS). Los complejos transitorios, que se caracterizan por altos constantes de disociación, suelen perderse con este enfoque. En el presente estudio, describimos un método novedoso para identificar interacciones transitorias entre proteínas utilizando entrelazado in vivo y identificación de proteínas basada en MS. Las células vivas se tratan con formaldehído, el cual permea rápidamente la membrana celular y genera entrelazamientos proteína-proteína. Las proteínas entrelazadas a una proteína de interés etiquetada con Myc son co-purificadas mediante cromatografía de inmunoafinidad y sometidas a un procedimiento que disocia los complejos entrelazados. Después de la separación por SDS-PAGE, las proteínas se identifican mediante espectrometría de masas en tandem. La aplicación de este método permitió la identificación de numerosas proteínas que se co-purificaron con una forma constitutivamente activa de M-Ras (M-Ras(Q71L)). Entre ellas, identificamos la proteína relacionada con RasGAP IQGAP1 como un nuevo socio de interacción de M-Ras(Q71L). Este método es aplicable a muchas proteínas y ayudará en el estudio de interacciones proteína-proteína.