Un protocolo para combinar proteínas fluorescentes con tintes histológicos para diversos componentes de la pared celular

La función de las plantas superiores depende de la compleja arquitectura tridimensional (3D) de los tejidos vegetales, sin embargo, la severa dispersión de la luz hace que la obtención de imágenes profundas de tejidos 3D sea muy problemática. Aunque los esfuerzos para 'despejar' los tejidos han estado en curso durante más de un siglo, muchas innovaciones se han hecho en los últimos años. Entre ellas, un protocolo llamado ClearSee despeja eficazmente los tejidos y reduce la autofluorescencia de la clorofila mientras mantiene las proteínas fluorescentes, lo que permite el análisis de la expresión génica y la localización de proteínas en muestras despejadas. Para aumentar aún más la utilidad de este protocolo, hemos desarrollado una caja de herramientas basada en ClearSee en la que se pueden utilizar varios tintes histológicos clásicos para la lignina, suberina y otros componentes de la pared celular en conjunto con líneas de reporteros fluorescentes. Encontramos que varios colorantes clásicos son altamente solubles en la solución ClearSee, lo que permite que los protocolos de tinción antiguos se simplifiquen enormemente; además, estos han sido inadecuados para la co-visualización con marcadores fluorescentes debido a la fijación y el despeje agresivos. La tinción consecutiva con varios colorantes permite la co-visualización 3D de distintas modificaciones de la pared celular con proteínas fluorescentes, utilizadas como reporteros transcripcionales o herramientas de localización de proteínas, en lo profundo de los tejidos. Además, el protocolo se aplica fácilmente en secciones manuales de diferentes órganos. En combinación con la microscopía confocal, esto mejora la calidad de la imagen mientras disminuye el tiempo y costo de embebido/sección. Así, proporciona un método de bajo costo y eficiente para estudiar tejidos vegetales gruesos que suelen ser engorrosos de visualizar. Nuestros protocolos adaptados de ClearSee mejoran significativamente y aceleran las investigaciones anatómicas y del desarrollo en numerosas especies vegetales, y esperamos que contribuyan a nuevos descubrimientos en muchas áreas de la investigación vegetal.