Contatos entre o fator TUF e sequências RPG.

O fator TUF da levedura liga-se especificamente a sequências semelhantes a RPG envolvidas em múltiplas funções em potenciadores, silenciadores e telômeros. Caracterizamos a interação do TUF com sua sequência de ligação ótima, rpg-1 (1-ACACCCATACATTT-14), utilizando um ensaio de ligação de DNA em gel em combinação com experimentos de proteção por metilação e mutagênese. Até 10 pares de bases parecem estar envolvidos na ligação do fator. A análise de uma coleção de 30 mutantes RPG diferentes demonstrou a importância de 8 pares de bases nas posições 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 e 12 e o papel crítico do par GC central na posição 5. Os dados de proteção por metilação em quatro sítios naturais diferentes confirmaram um contato próximo nas posições 4, 5, 6 e 10 e sugeriram contatos adicionais nos pares de bases 8, 12 e 13. A sequência consensual derivada foi RCAAYCCRYNCAYY. Uma análise de deslocamento de banda quantitativa foi utilizada para determinar a constante de dissociação em equilíbrio para o complexo de TUF e seu sítio de ligação ótimo rpg-1. A constante de dissociação específica (K8) foi encontrada como 1,3 x 10(-11) M. A comparação do valor de K8 com a constante de dissociação obtida para sítios de DNA não específicos (Kn8 = 8,7 x 10(-6) M) mostra a alta seletividade de ligação do TUF para seu alvo RPG específico.