Application of real-time PCR and high resolution melting (HRM) analysis for authentication of honey

Honig gilt als begehrter natürlicher Süßstoff, der wegen seiner geschmacklichen Eigenschaften und seiner positiven Auswirkungen auf die Gesundheit geschätzt wird, die von der Art der Pflanzen abhängen, aus denen er gewonnen wird. Sein hoher Marktpreis macht Honig zu einem attraktiven Ziel für Betrug. Honig kann mit billigeren Zuckersirupen (Reis, Mais, Rüben oder Zuckerrohr) verdünnt werden, ohne dass dies leicht zu erkennen ist. Honig ist auch besonders anfällig für falsche Kennzeichnung und Fälschung seiner geografischen und botanischen Herkunft. Daher sind zuverlässige Analysemethoden zur Honigauthentifizierung unerlässlich, um die Produktqualität und den Verbraucherschutz zu gewährleisten. Das Ziel dieser Studie war es, das Potenzial der real-time PCR in Kombination mit einer hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse (HRM) für die Authentifizierung von Honig zu untersuchen, der in Österreich und anderen europäischen Ländern erhältlich ist. Unser Ansatz basierte auf der Amplifikation polymorpher Regionen (16S rDNA und COI) der Honigbiene Apis mellifera und der Pflanzen-DNA (rbcL und ITS2) mittels real-time PCR und der Unterscheidung von A. mellifera Unterarten bzw. Arten bei Pflanzen anhand der Unterschiede im Schmelzverhalten der Amplikons. Die DNA wurde unter Verwendung des Dneasy mericon Food Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Als Positivkontrollen wurde auch DNA aus Honigbienenproben extrahiert, die in Österreich, Nordmazedonien, Bosnien und Herzegowina und Kroatien gesammelt wurden, sowie aus Pflanzensamen und -blättern, die in Honig vorkommen können, darunter Mais und Reis, da diese häufig als Sirup Zusätze verwendet werden. Die extrahierte DNA wurde mit einem Qubit-Fluorimeter quantifiziert. Primer Paare für die Amplifikation von Honigbienen (A. mellifera) DNA und Pflanzen-DNA wurden der Literatur entnommen und in silico getestet. Bei Bedarf wurden die Primer modifiziert, um größere Ähnlichkeit der Annealing-Temperaturen und bessere HRM-Ergebnisse und zu erzielen. Da in verschiedenen Ländern unterschiedliche Unterarten der Honigbiene A. mellifera vorkommen, wurden die mit dem COI Assay erhaltenen PCR Produkte sequenziert, um SNPs in der amplifizierten Region zu detektieren. Die Pyrosequenzierung dieser Amplikons ermöglichte es, den Genotyp verschiedener Honigbienen spezifischen Schmelzprofilen zuzuordnen. Diese Methode wurde bereits auf 56 Honigproben aus Österreich und anderen europäischen Ländern angewandt. Zusätzlich wurden physikalisch-chemische Parameter bestimmt: der Wassergehalt wurde mittels Refraktometrie ermittelt und außerdem wurde die elektrische Leitfähigkeit gemessen. Darüber hinaus wurde eine NMR-Analyse von 20 ausgewählten Honigproben durchgeführt, um ihre chemische Zusammensetzung besser zu verstehen und mögliche Merkmale des NMR-Fingerabdrucks jeder Honigsorte zu identifizieren.