Poly(A)-seq：転写体ポリ(A)テールの直接シーケンシングと分析のための方法

真核生物のメッセンジャーRNAの3'末端にあるポリ(A)テールは、mRNAの安定性と翻訳効率を制御します。さまざまなNGS手法によって促進され、遺伝子転写物の3'-UTR長を決定する代替ポリアデニル化部位が広範囲にわたり研究されています。しかし、動的および発達的な調節を示すポリ(A)長は依然としてほとんど探求されていません。最近開発されたゲノム全体のポリ(A)プロファイリングのためのNGSベースの手法は、ゲノム全体のポリ(A)動態の研究を促進しました。ここでは、cDNAライブラリ構築のために直接の3'-末端アダプターリガーションと5'-末端アダプターリガーションのためのテンプレートスイッチングを適用したポリ(A)プロファイリングのための簡便なNGS手法を提示します。ポリ(A)長は自己開発したパイプラインpA-finderを用いて塩基コールデータから直接計算されます。ライブラリは、まずNextSeq 500で300-ntのシングルエンドリードを生成することによって3'-UTR領域からポリ(A)テールに直接シーケンスされ、この方法の実現可能性を示し、cDNAライブラリ構築のために細断RNAサイズを最適化することでより長いポリ(A)テールを検出できることがわかりました。次に、40-ntおよび120-ntのポリ(A)テールスパイクインRNAを含むポリ(A)-seq cDNAライブラリをHiSeq X-tenおよびNovaSeq 6000に適用し、150-ntおよび250-ntのペアエンドリードを取得しました。スパイクインRNAのシーケンシングプロファイルは、ポリ(A)テールの読み取りにおいて高い精度と高いクオリティスコアを示しました。ポリ(A)信号が3'アダプター配列に流出し、接合部ではクオリティスコアが急激に低下することが観察され、ホモポリマー信号の流出を除去するためのpA-finderの修正が可能になりました。ポリ(A)-seqの広範な応用が、発達および疾患関連のポリ(A)動態と調節、最近出現した混合テーリング調節の研究を促進することを期待しています。