Perturbações genômicas massivamente paralelas com CRISPR de múltiplos alvos interrogam a atividade da Cas9 e a reparação do DNA em locais endógenos

Aqui apresentamos uma abordagem que combina um sistema de repetições palindrômicas curtas regularmente espaçadas em clusters (CRISPR) que simultaneamente visa centenas de locais genômicos endógenos epigeneticamente diversos com sequenciamento de alto rendimento para medir a dinâmica da Cas9 e as respostas celulares em grande escala. Esta multiplexação maciça de CRISPR é possibilitada por meio de RNAs guias de múltiplos alvos (mgRNAs), RNAs guias degenerados que direcionam a Cas9 para um número predeterminado de locais bem mapeados. Os mgRNAs revelaram percepções generalizáveis sobre a ligação e clivagem da Cas9, revelando a rápida saída da Cas9 pós-clivagem e a carga de fatores de reparo no DNA genômico próximo ao motif adjacente ao protospacer. Além disso, ao contornar efeitos confusos da sequência do RNA guia, os mgRNAs desvelaram que a ligação da Cas9 é aumentada em regiões acessíveis à cromatina, e a clivagem pela Cas9 ligada é mais eficiente perto de regiões transcritas. Combinados com a ativação e desativação mediadas por luz da atividade da Cas9, os mgRNAs possibilitaram ainda o estudo de alto rendimento da resposta celular a quebras de fita dupla com alta resolução temporal, revelando a presença, a extensão (menos de 2 kb) e a cinética (~1 h) da descompactação da cromatina induzida por dano ao DNA reversível. No total, este trabalho estabelece os mgRNAs como uma plataforma generalizável para a multiplexação de CRISPR e avança nossa compreensão da atividade intracelular da Cas9 e da resposta ao dano ao DNA em loci endógenos.