ompT codifica a protease da membrana externa de Escherichia coli que cliva a RNA polimerase T7 durante a purificação

A RNA polimerase T7 do bacteriófago é estável em Escherichia coli, mas muito suscetível ao clivagem por pelo menos uma endoprotease após a lise celular. A principal fonte dessa atividade endoprotease foi encontrada na membrana externa da célula. Um ensaio rápido em células inteiras foi desenvolvido para rastrear diferentes linhagens quanto à presença dessa atividade proteolítica. Usando esse ensaio, identificamos algumas linhagens comuns de laboratório que carecem totalmente da protease. Análises genéticas e de Southern dessas linhagens nulas nos permitiram concluir que a protease que cliva a RNA polimerase T7 é a OmpT (anteriormente chamada de proteína a), uma endoprotease conhecida da membrana externa, e que o fenótipo nulo resulta da deleção do gene estrutural da OmpT. Um plasmídeo recombinante contendo o gene ompT permite que essas linhagens de deleção sintetizem OmpT e as converte em um fenótipo positivo para protease. O plasmídeo levou à superprodução da proteína OmpT e da atividade proteásica nas linhagens E. coli K-12 e B que utilizamos, mas apenas uma expressão fraca na linhagem E. coli C, C1757. Essa diferença dependente da linhagem na expressão de ompT foi investigada em relação à influência conhecida de envZ na síntese de OmpT. Uma pequena deleção na região de ompT do plasmídeo diminui consideravelmente a quantidade de proteína OmpT e a protease codificada pelo plasmídeo presentes nas membranas externas. O uso de linhagens de deleção de ompT para produção de RNA polimerase T7 a partir do gene clonado tornou a purificação da RNA polimerase T7 intacta rotineira. Essas linhagens podem ser úteis para a purificação de outras proteínas expressas em E. coli.