Uso de lise celular regulada em uma seleção genética letal em Escherichia coli: identificação da região de ligação do autoindutor da proteína LuxR de Vibrio fischeri ATCC 7744

Uma seleção genética letal utilizando os genes de lise do bacteriófago lambda (S, R, RZ) foi desenvolvida e utilizada em conjunto com um teste de luminescência para permitir a isolamento e caracterização de seis mutações missense e duas mutações nonsense no gene luxR de Vibrio fischeri ATCC 7744. Uma fusão transcricional dos genes de lise no operonR a jusante de um gene luxI truncado permite o controle da lise celular pela adição de autoindutor sintético ao meio de cultivo. As seis mutações missense isoladas resultaram em mudanças na proteína LuxR de Asp na posição 79 para Asn (daqui em diante designada como D79N), V82I, V109L, L118F, S123I e H217Y. As proteínas LuxR variantes com mudanças nos aminoácidos de D79N, V82I, V82L e H127Y mostraram exigir concentrações mais altas de autoindutor para elicitar uma certa amplitude de resposta do que a exigida pela proteína selvagem. Acreditamos que o agrupamento de um total de sete mutações missense geradas aleatoriamente em uma região de 49 aminoácidos da sequência primária da LuxR define uma porção crítica da proteína LuxR. A observação de que proteínas com lesões nesta região responderam a níveis elevados de autoindutor sugere que o local de ligação do autoindutor é construído, pelo menos em parte, a partir de vários resíduos de aminoácidos dentro da região de 79 a 127 da proteína LuxR.