Molekulare Typisierung von Neisseria gonorrhoeae-Isolaten durch Pyrosequenzierung hochgradig polymorpher Segmente des porB-Gens

Für die Prävention und Kontrolle von Gonorrhoe ist eine objektive, hoch diskriminierende und reproduzierbare molekulare epidemiologische Charakterisierung von Neisseria gonorrhoeae entscheidend. In der vorliegenden Studie wurde zur Bereitstellung solcher Eigenschaften die Pyrosequenzierungstechnologie, eine schnelle Echtzeit-DNA-Sequenzanalyse, auf sechs kurze, hochgradig polymorphe porB-Genabschnitte angewendet, gefolgt von der Bestimmung des genetischen Typs (Genovar) der bakteriellen Isolate. Die Sequenzierungsvorlagen wurden durch Echtzeit-PCR-Amplifikation gewonnen, die auch eine Fluoreszenz-Schmelzkurvenanalyse des gesamten porB-Gens umfasste, um die Genogruppen (porB1a oder porB1b Allel) vor der Pyrosequenzierungsanalyse zu bestimmen. Das verwendete PSQ 96 MA-System ermöglichte die schnelle (in etwa 1,5 h) Bestimmung von 96 Sequenzen von jeweils 20 bis 65 korrekten Nukleotiden. Die Ergebnisse waren reproduzierbar und größtenteils mit den Ergebnissen der konventionellen Sanger-Dideoxy-Sequenzierung übereinstimmend, mit Ausnahme kürzerer Leselängen und gewisser Unsicherheit bei der Bestimmung der korrekten Anzahl identischer Nukleotide in homopolymerischen Segmenten. Die Anzahl der in jedem der sechs hochgradig polymorphen Segmente der porB1a- und porB1b-Allele (die Oberflächen-exponierte Aminosäure-Schleifen des reifen PorB-Proteins kodieren) identifizierten Sequenzvarianten reichte von 5 bis 11 bzw. von 8 bis 39. Unter den porB1a-Isolaten (n = 22) und porB1b-Isolaten (n = 65) wurden jeweils 22 und 64 einzigartige Genovare identifiziert. Alle Isolate waren typisierbar. Die vorliegenden Ergebnisse belegen eine hohe Diskriminierungsfähigkeit, praktisch dieselbe wie bei der Sequenzierung des gesamten porB-Gens. Zusammenfassend kann die schnelle und hochdurchsatzfähige Pyrosequenzierungstechnologie zur molekularen epidemiologischen Charakterisierung von N. gonorrhoeae eingesetzt werden.