IncWプラスミドR388によってコードされるタンパク質TrwDは、細菌の接合に必須なATP加水分解活性を示す

プラスミドR388 DNAの接合転送領域から1.7キロベース対のセグメントがクローニングされ、シーケンス解析された。これは、プラスミドR388の接合、接合性W-ピルスの発現、ファージPRD1に対する感受性に必須な遺伝子trwDを含んでいた。TrwDの推定アミノ酸配列は、さまざまな輸送プロセスに関与する潜在的ATPアーゼのPulE/VirB11スーパーファミリーとの相同性を示した。glutathione S-トランスフェラーゼ(GST)とのtrwDの融合体が構築され、得られた融合タンパク質は過剰発現する細菌から精製された。GST-TrwDのFactor Xa加水分解とさらなる精製により、95%以上の純度のTrwDタンパク質が得られた。TrwDに対して抗体が育てられ、Escherichia coliの可溶成分と外膜の両方に局在していることが明らかになった。TrwDはおそらく周辺外膜タンパク質であり、溶解バッファー中のNaCl濃度を0.5 Mに増加させることで可溶化できた。精製されたGST-TrwDおよびTrwDはATPを加水分解できた。ATP加水分解活性は、界面活性剤-リン脂質混合ミセルの存在下で2倍に増加した。TrwDに存在するヌクレオチド結合部位の重要性を研究するために、保存されたリジン残基がグルタミンに置き換えられた。変異体タンパク質は、野生型と同じ条件下で発現および精製されたが、ATP加水分解活性を示さなかった。TrwD(K203Q)はR388変異体プラスミドのtrwDの変異を補完することができず、このタンパク質のATP加水分解活性が接合過程において必須であることを示唆している。さらに、この変異の優性は、GST-TrwD(K432Q)が自身または接合機構の他の成分と相互作用することができることを示唆している。