Identificação e caracterização funcional de um sítio de ligação do domínio de homologia Src 3 no Cbl

Cbl é uma proteína adaptadora e ligase de ubiquitina que se liga e é fosforilada pela quinase de tirosina não-receptora Src. Mostramos anteriormente que a interação primária entre Src e Cbl é mediada pelo domínio de homologia Src 3 (SH3) da Src, ligando-se a sequências ricas em prolina do Cbl. O peptídeo Cbl RDLPPPPPPDRP(540-551), que corresponde aos resíduos 540-551 do Cbl, inibiu a ligação de uma proteína de fusão GST-Src SH3 ao Cbl, enquanto RDLAPPAPPPDR(540-551) não inibiu, sugerindo que a Src se liga a esse sítio no Cbl em uma orientação de classe I. A mutação das prolinas 543-548 reduziu a ligação da Src ao fragmento Cbl 479-636 significativamente mais do que a mutação das prolinas no motivo PPVPPR(494-499), que foi relatado anteriormente como se ligando à Src SH3. Mutar as prolinas do Cbl 543-548 para alaninas reduziu substancialmente a ligação da Src ao Cbl, a fosforilação induzida pela Src do Cbl e a inibição da atividade da quinase Src pelo Cbl. A expressão do Cbl mutado em osteoclastos induziu uma redução moderada na atividade de reabsorção óssea e aumentou a quantidade de proteína Src. Em contraste, desabilitar o domínio de ligação da quinase de tirosina do Cbl de comprimento total, mutando glicina 306 para ácido glutâmico e, assim, impedindo a ligação descrita anteriormente do domínio de ligação da quinase de tirosina ao fosfotirosina 416 da Src, não teve efeito na fosforilação do Cbl, na inibição da atividade da Src pelo Cbl de comprimento total ou na reabsorção óssea. Esses dados indicam que a sequência Cbl RDLPPPP(540-546) é um sítio de ligação funcionalmente importante para a Src.