Ensayo competitivo basado en cuentas con duplex para inhibidores de quinasas de proteínas

ANTECEDENTES: Muchas cascadas de transducción de señales celulares tienen quinasas de proteínas como componentes críticos. Los inhibidores de quinasas de proteínas de moléculas pequeñas pueden ser efectivos como sondas de laboratorio y medicamentos. Los métodos que permiten evaluar dos o más quinasas simultáneamente para la inhibición por una molécula pequeña permitirían pruebas inequívocas de especificidad y selectividad de acción de la molécula pequeña. MÉTODOS: Se expresaron dos quinasas similares a receptores de activina con etiqueta hexahistidina en E. coli, se purificaron y se unieron a cuentas de níquel. Se desarrolló un ligando quinasa fluorescente (F-KL) que se une al sitio de unión de ATP de estas quinasas con afinidad en nanomoles. La unión de F-KL con la quinasa en la cuenta hizo que las cuentas brillaran, y los inhibidores disminuyeron el brillo. RESULTADOS: Un panel de prueba de 17 inhibidores de quinasas no fluorescentes, que abarcaban dos órdenes de magnitud de afinidad para las quinasas, dio valores K(d) para las quinasas que se correlacionaron bien con un ensayo de polarización de fluorescencia. Se obtuvieron resultados para las quinasas en duplex, utilizando un muestreador automático para enviar cuentas de una placa de 96 pocillos a un citómetro de flujo en un formato adecuado para tamizaje de alto rendimiento. CONCLUSIONES: Los inhibidores de quinasas pueden ser medidos en duplex en un formato de alto rendimiento mediante citometría de flujo, si se dispone de un ligando fluorescente adecuado.