Messenger-RNA (mRNA) ist ein biologisches Polymer von zentraler Bedeutung für die Zellbiologie, da es Informationen von der DNA im Zellkern an die Proteinproduktionsmaschinerie im Zytoplasma weiterleitet. Es ist bekannt, dass mRNA zusammen mit zahlreichen Proteinpartnern Komplexe bildet, die als Ribonukleoprotein (RNP)-Partikel bezeichnet werden, und dass die spezifische Zusammensetzung von mRNPs tiefgreifende Auswirkungen auf die Stabilität, den Transport im Zellkern, den Export und die Translation von mRNA hat. Trotz aller Erkenntnisse über die Struktur und Rolle der Proteinkomponente von mRNPs ist über die Ultrastruktur der darin enthaltenen mRNA nur wenig bekannt. In dieser Arbeit stelle ich Werkzeuge für die multiplexierte optische Nanoskopie vor, insbesondere für Szenarien mit niedrigem Signal-Hintergrund-Verhältnis (SBR), wie z. B. im Zellkern, und wende sie auf die Bildgebung von zellulärer mRNA an. Dazu trage ich zunächst zur Entwicklung und Validierung eines verbesserten MINFLUX-Mikroskops bei, das unter anderem besonders für die Bildgebung mit niedrigem SBR geeignet ist. Anschließend zeige ich die Entwicklung einer Multiplexing-Methode, die auf Signalkombinationen basiert, um eine DNA-PAINT-Bildgebung mit hoher Zielanzahl durchzuführen. Mit dieser Methode sind im Vergleich zu herkömmlichem DNA-PAINT weniger Bildgebungsschritte erforderlich, um eine bestimmte Anzahl von Zielen abzubilden, was die Bildgebung beschleunigt und vereinfacht. Durch die Kombination von optimierter RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit kombinatorischem DNA-PAINT zeige ich die multiplexe Bildgebung mehrerer Regionen mehrerer mRNAs von Interesse in Säugetierzellen und extrahiere geometrische Merkmale dieser Partikel im Zellkern und Zytoplasma. mRNAs scheinen im Zellkern in Abhängigkeit von der Intron-Dichte verdichtet zu sein und nehmen insgesamt längliche und oft nicht-konvexe Formen an. Schließlich verwende ich das zuvor entwickelte MINFLUX-Mikroskop, um die ersten 3D-MINFLUX-RNA-FISH-Bilder von nukleären und zytoplasmatischen mRNAs zu erhalten. Diese Werkzeuge ermöglichen insbesondere die Untersuchung der mRNA-Ultrastruktur und vereinfachen allgemein die multiplexe DNA-PAINT-Bildgebung – Fortschritte, von denen ich hoffe, dass sie von der Bildgebungsgemeinschaft übernommen werden.
Alessandro Passera (Thu,) studied this question.