La insulina y el factor de crecimiento derivado de plaquetas estimulan la fosforilación del producto c-raf en residuos de serina y treonina en células intactas.

Hemos examinado la fosforilación de la quinasa de serina y treonina, el producto del proto-oncogén c-raf en respuesta a la insulina o al factor de crecimiento derivado de plaquetas en células intactas. Tanto la insulina como el factor de crecimiento derivado de plaquetas estimularon la fosforilación de la proteína c-raf aproximadamente de 2 a 3 veces. La fosforilación ocurrió exclusivamente en residuos de serina y treonina; no se detectó fosfotirosina. En ensayos de quinasa de complejo inmunológico, el tratamiento con insulina y el factor de crecimiento derivado de plaquetas aumentó la autofosforilación de la quinasa c-raf, sugiriendo la activación de su actividad quinasa. Para investigar si la fosforilación de la proteína c-raf en células intactas resulta de un evento de autofosforilación o de la fosforilación por otra(s) quinasa(s) celular(es), reemplazamos la lisina 375 en el dominio hipotético de unión al ATP de la proteína c-raf con alanina utilizando mutagénesis dirigida por oligonucleótidos y expresamos la proteína mutada en células NIH3T3. La sustitución resultó en la inactivación de la autofosforilación específica de serina/treonina en ensayos de quinasa de complejo inmunológico. Sin embargo, en células intactas, aunque la fosforilación de la proteína mutante en respuesta a la insulina y el factor de crecimiento derivado de plaquetas ocurrió en menor medida que la de la proteína de tipo salvaje, los mapas de fosfopeptidos eran indistinguibles. Estos resultados sugieren que la fosforilación de serina y treonina podría ser responsable de la activación de la quinasa c-raf tras el tratamiento de las células con insulina y el factor de crecimiento derivado de plaquetas, y que la mayor parte del fosfato asociado con la proteína c-raf resulta de su fosforilación por quinasa(s) celular(es) de serina/treonina aún no caracterizada(s).