酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）线粒体中一种鱼藤酮不敏感性 NADH: Q6 氧化还原酶的纯化与表征

通过一种简便的方法从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞中分离出了一种线粒体 NADH:Q6 氧化还原酶，该方法包括使用 Triton X-100 从线粒体膜中提取该酶，随后进行 DEAE-纤维素和 blue Sepharose CL-6B 层析。通过该流程，相对于全细胞实现了 2000 倍纯化，相对于线粒体实现了 150 倍纯化。SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，纯化的 NADH 脱氢酶由分子量为 53 kDa 的单一亚基组成。该酶含有非共价结合的 FAD 作为唯一辅基，Em,7.6 = -370 mV，且不含铁硫簇。该酶对 NADH 具有特异性，表观 Km = 31 microM，并被发现可被黄酮（I50 = 95 microM）抑制，但不受鱼藤酮或粉蝶霉素抑制。纯化后的酶可以利用泛醌-2、-6 或 -10、甲萘醌、二氯酚吲哚酚或铁氰化物作为电子受体，但反应速率不同。以泛醌-2 作为受体时获得了最大的 NADH 转化数（2500 s-1）。以天然泛醌-6 为受体时，该值为 500 s-1。NADH:Q2 氧化还原酶活性在 pH 6.2 时达到最大值，而 NADH:Q6 氧化还原酶活性在 pH 4.5-9.0 之间保持恒定。细胞中该酶的含量受葡萄糖阻遏；当在葡萄糖或乳酸中生长的细胞进入静止期时，其含量略有增加。迄今为止进行的实验表明，本研究纯化的酶是结合在线粒体内膜上的外源性 NADH:Q6 氧化还原酶，并参与胞质 NADH 的氧化。讨论了该酶与来自酵母和植物线粒体的其他各种 NADH 脱氢酶的关系。